第五章 肿瘤的血管形成与抗血管形成治疗
实体肿瘤的生长及存活依赖血管形成,现在这已为广大的肿瘤学家们所公认。早在200多年前，英国外科医生John Hunter首先 提出了“angiogenesis（血管生成）”的术语，用以描述正在发育期间驯鹿角中新生血管的生长。100多年前人们就已发现,肿瘤组织较正常组织富含血管,但普遍认为这种血管反应只是一 种炎症反应，并非肿瘤生长所必需。直到1971年, 直到1971年, 肿瘤血管形成研究的先驱美国波士顿儿童医院的 Judah Folkman 博士才首次提出了“肿瘤生长依赖于血管生成（tumor angiogenesis）”的观点。Folkman指出，一旦肿瘤发生，任何数量的肿瘤细胞增加，都必将伴有新毛细血管的形成。新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给,同时它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径；而在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散。这就是严重地限制了肿瘤细胞的生长。
抗肿瘤血管形成疗法将成为崭新的抗癌手段。肿瘤的生长和转移与肿瘤区血管有着密切的关系。实体瘤及其转移大概在１－
一．肿瘤生长依赖血管形成的依据
1971年，Folkman博士在《新英格兰医学杂志》上首先提出了肿瘤生长依赖血管形成的概念（Tumor growth is angiogenesis dependent）：无论何种抗肿瘤新生血管形成的技术，都将是对现有肿瘤治疗学的强有力的补充。后来这一观点得到了许多学者的赞同，为肿瘤的研究开辟了一个新的天地。人们经过大量的研究进一步证实了新生血管形成与肿瘤发生、发展的关系，并且研究发现了许多抗新生血管形成的技术及制剂，这些制剂及方法在体外及体内实验中取得了喜人的结果。
早在1945年，人们在研究创伤及肿瘤对血管的影响时，就发现了一个有趣的现象，将肿瘤细胞置于一个有半透膜的小室内，然后将此小室埋在小鼠的皮下，结果发现小室内的肿瘤细胞在新生血管形成前生长缓慢，而当小室内有新生血管形成后，肿瘤细胞生长迅速加快；同时也发现在小室的半透膜面，新生血管形成丰富，提示新生血管形成对肿瘤生长有利；而肿瘤细胞本身也有诱导新生血管形成的作用。
早期的研究还发现，移植于离体的灌注脏器内肿瘤，因在灌注脏器是没有血管形成的，所以肿瘤在离体灌注的脏器内生长缓慢，肿瘤保持在1－
动物实验发现，将肿瘤细胞团混悬于眼前房中，因前房中无血管形成，所以肿瘤体积始终保持在
鸡胚尿囊膜模型研究证明，在无血管期肿瘤生长通常受到明显的限制，肿瘤的直径多在0.93±
1989年Folkman等在《自然》杂志上发表了一个转基因小鼠的实验结果，在鼠胰腺β细胞中转入SV40 T oncoprotein基因后，β-细胞在4~6周时，即出现增生现象，9.5周时约50%的胰岛出现增生的β-细胞；但仅有一小部发生癌变。通过体内外的研究发现，能引起新生血管形成的增生细胞与肿瘤的发生之间有着密切的关系；而良性增生往往不伴有诱生新生血管的能力。提示血管形成在肿瘤的发生过程中有重要的作用。
以上的研究都证明，肿瘤与血管形成之间有着密切的关系，虽然未能直接地证明肿瘤的生长是依赖血管形成的，但是间接地提示了这一现象中的一种必然联系的存在。
|
图1。 肿瘤生长的过程中诱导血管形成。 |
然而 ，从20世纪80年代末开始，人们找到许多直接的证据证明，肿瘤的生长是依赖血管的。
1993年Kim等发表的一个裸鼠研究结果证明，有三株人肿瘤细胞生长是依赖于血管内皮细胞生长因子（VEGF）对新生血管形成的促进作用，应用抗VEGF的抗体肿瘤的生长。
Gross 及Hori等分别报告，腹腔内注射碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）后可以刺激原发肿瘤的生长及转移；而使抗bFGF的特异性抗体后，可以抑制70%对bFGF刺激的血管形成依赖的肿瘤的生成。
烟曲霉素的衍生物TNP-470是一个作用明确的血管形成抑制剂，在动物体内可以明显抑制原发肿瘤及转移的发生。TNP-470抑制肿瘤有剂量依赖性。使用TNP-470后，B16BL6黑色素瘤、M5076视网膜细胞肉瘤、Lewis肺癌及 walker256肿瘤的大小分别减少到对照相的16、10、17及4％。同时，TNP－470还抑制可以M5076肉瘤的肝转移。
Millauer 等使用逆转录病毒将突变的位点缺陷VEGF受体FLK－1转导至脑胶质瘤中，结果肿瘤的血管形成受到抑制，肿瘤生长亦受到明显抑制。
二．血管形成的临床意义
上述研究从直接及间接间的方面都证明了血管形成在肿瘤的发生及转移中起着重要的作用。在临床上这同样具有重要的意义，肿瘤血管形成与肿瘤转移及预后密切机关。
1992年，Macchiarini报道了肺癌中血管形成研究的结果，作者对87例T1N
Saclarides研究大肠癌患者，血管密度与预后的关系发现，血管密度在病变已穿透粘膜及5年内死亡的患者明显高（P＝0.002及P＝0.013）；同时，发现血管密度中每增加10，复发率则增加2.7倍。
还有很研究证明血管密度与鼻咽癌，卵巢癌，胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌，膀胱癌、胃癌等肿瘤的预后及转移之间都有密切的相关性。
|
图2。血管密度与肿瘤转移呈正相关。 |
|
图3。在乳腺癌病人中，血管密度对病人的生存有明显的影响。 |
三．血管形成的发生机制
血管形成在肿瘤的发生中很重要，在临床上与肿瘤患者的预后及转移密切相关。
但迄今人们对血管形成的机制仍不甚明了，血管形成是一个极复杂的病理生理过程，包括许多的环节。通常认为肿瘤血管形成的过程主要包括以下几个步骤：①血管内皮下基底膜溶解及内皮细胞活化；②内皮细胞向肿瘤组迁移；③内皮细胞增殖；④形成血管。
在这一过程中包含了肿瘤细胞与正常内皮细胞相互作用、它们与细胞外基质的相互作用、相关细胞的参与及大量白细胞因子的调节程度，使得新生血管得以形成。在正常的情况下，血管形成是受到严格地调控的，而在肿瘤组织中这种平衡完全倾向血管形成一方。
|
图5。血管形成过程中有许多细胞、细胞因子参与这一过程。 |
从基因水平看，癌基因的活化使细胞具备一些促血管形成的能力，如释放一些蛋白酶，化学趋化因子及促血管形成因子等，而抑癌基因则可以抑制肿瘤的转移能力，如P53，nm-23等。
肿瘤内的新生血管是从原有的血管基础上“芽生”而来的，肿瘤细胞及由化学趋化因子招引来的巨噬细胞等释放蛋白降解酶，如金属基质蛋白酶家族（Metal Matrix Proteinazex,MMPS），它们可以降解基质，基底膜等，使静止的内皮细胞被活化，同时，基质降解后，一些储于基质中的生长因子被释放出来，可进一步刺激内皮细胞增殖。
|
图4。肿瘤的发生发展过程中，血管形成始终发挥重要的作用。 |
促进血管形成的因素中，生长因子是一个重要的组成部分（见表1），肿瘤细胞可以产生一部分，更主要的是招引来的细胞可以产生大量的细胞因子刺激血管内皮细胞增殖，迁移及小管形成。其中活性较强的因子包括酸性及碱性纤维母细胞生长因子，（aFGF及bFGF），血管内皮细胞生长因子（VEGF）及内皮细胞生长因子（EGF）等。
在多种肿瘤组织中，VEGF往往大量存在于肿瘤坏死与活跃长生的细胞之间的区域，提VEGF可能是这些肿瘤血管生成中最重要的介质。内皮细胞表而存在有大量的VEGF受体（VEGFR、flki/flt-1）许多因子通过调节VEGFR的表达来调控血管的形成。
五．抗血管形成在肿瘤治疗中的意义和相关药物
血管形成为肿瘤细胞生长提了条件，肿瘤细胞的生长需要有血管形成，而血管的增生亦为肿瘤转移提供了条件，肿瘤细胞可以通过不成熟的毛细血管进入血流形成转移。所以人们选择了血管形成作为一个肿瘤的靶点。同时，血管形成作为靶点，还有一个有利的条件，在正常的成人中，除了创伤愈合及生殖周期外，几乎所有的新生血管形成都是病理性的，如肿瘤、风湿性关节炎及糖尿病视网膜病变等。所以选择这一靶点也更安全、毒副作用更小的治疗方法。
如何阻断血管形成这一病理过程，从理论讲可以有以下几个方面：①抑制蛋白降解酶的活性，防止内皮细胞活化；②干扰血管生成因子的合成、释放及生物效应的发生；③阻止内皮细胞的增殖；④阻止内皮细胞的迁移。
近十余年来，人们寻找抗血管形成药物方面作出了很大的努力，并且已使很多的临床医生看到了它们的前锦。在美国已有20种以上的制剂在进行临床验证，有的Ⅰ、Ⅱ期，有的已经到了Ⅲ期。
在研究的药物中包括有内源性的，也有外源性的。
1994年，O’Reilly博士等在Folkman博士的实验室发现一种有趣的现象，荷Lewis肺癌的小鼠，一旦Lewis肺癌从移植部位切除后，在肺内会很快出现肺转移的现象，其肺内转移灶的数目，可以达到原发灶未切除鼠的10倍。他们推测Lewis肺癌细胞产生某种抑制肿瘤转移的物质。Folkman等使用重度联合免疫缺陷（SCID）鼠的模式，同样证实了这一结果，说明免疫功能在这一现象中不是重要的。
后来发现荷Lewis肺癌小鼠的血清及经过透析与浓缩的小便均可以抑制小鼠体内转移癌的发生，并且发现他都可以明显抑制牛毛细血管内皮细胞的增殖。而正常小鼠的血清及尿液则无此作用。
为了找到这一抑制血管形成活性的物，Folkman博士及其同事们终于从荷Lewis肺癌小鼠的血及尿液中分离出一种分子量为38kb的蛋白质，并证明了它抑制血管内皮细胞增殖的活性。通过对此蛋白质进行测序后发现，该蛋白质与人纤维蛋白酶原的片段有98％的同源性。他们为这一蛋白质命名为血管抑素（Angiostation）。
为了证明人血纤维蛋白溶酶原来的血管抑素确有抑制肿瘤转移的作用，他们在小鼠的模型中使用了血管抑素，结果发现使用血管抑素组的1/18（P〈0.001 〉。
进一步的研究，他们又发现了内皮抑素（endstatin），并证明血管抑素与内皮抑素联合使用将更加有效。虽这两种药品已由美国恩特利医药公司生产，但临床试验结果不理想。
另外，还有许多制剂亦在研究中，抑制MMPS是控制血管形成的重要组成部分，如Matrimastat. Bay 12-9566及AG3340等已进入Ⅲ期临床。
自然产生的血管生长抑制因子是体内调节血管形成的重要组成成份，PF4，IL－12等抑制血管内皮细胞增殖的因子已经开始进入Ⅱ期临床。
还有一些拮抗刺激血管内皮增殖、移动及小管形成的生长因子的药物亦开始的临床应用研究，RhuMabVEGF已进入 Ⅱ/Ⅲ期临床SU5416正开始进行Ⅰ期临床。
直接抑制内皮细胞增殖的药物TNP－470已进行了Ⅰ,II期临床验证，被认为是一个较有前景的药物。
TNP－470[AGM-1470,O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol]是一种半合成的烟曲霉素（fumagillin）衍生物。从Aspergillus fumigatus发酵液中分离的烟曲霉素能够抑制体外内皮细胞的增殖和体内肿瘤诱导的血管生成，抑制肿瘤在小鼠体内的生长，但同时也引起小鼠体重的严重下降。在烟曲霉素碱水解产物--霉醇（fumagillol）结构的基础上合成的TNP－470毒性较低，其抑制体外血管内皮细胞生长的能力比烟曲霉素要强50倍以上。TNP－470能抑制小鼠Lewis肺癌、B16黑色素瘤、M5076视网膜细胞肉瘤、Meth A肉瘤、结肠癌以及EHS肉瘤等多种肿瘤的生长，对体外培养的人肿瘤细胞（如HL－60、鳞状细胞LS－180、HSC－1和结肠癌COLO-05）也有显著的生长抑制作用。小鼠皮下注射TNP－470（30mg/kg）100天以上未观察到脱毛、内分泌紊乱、感染等明显副作用。TNP－470能显著抑制鸡胚尿囊膜和大鼠角膜血管生成，抑制大鼠海绵移植模型中bFGF诱导的血管生成；在大鼠血管器官培养中，能选择性抑制内皮细胞形成毛细血管状结构，但对非内皮细胞生长几乎不产生影响。动物实验证实，TNP－470对小鼠肾癌、人恶性胶质细胞瘤、雌激素诱导的大鼠唾腺瘤及兔VX－2癌的生长都有抑制作用，并能延长Walker256癌的荷瘤小鼠的存活期；TNP－470还能剂量依赖性地降低B16－BL6实验性转移的肺克隆数，延长荷瘤小鼠存活期一半以上；也能显著降低M5076肉瘤肝转移灶的数目，延长一倍以上荷瘤小鼠的存活期。另外，TNP－470对移植在裸鼠上的人肿瘤的原位生长和转移扩散都 有显著抑制作用，还表现出与多种抗肿瘤药和血管生成抑制剂的协同作用。TNP－470正在Ⅰ期临床试验。由于这一药物在动物体内表现出低的毒副作用和理想的抗肿瘤增殖转移效果，TNP－470有希望成为一种较为理想的抗恶性肿瘤增殖和转移的药物。
另有一些药物虽然其作用机制不清，但确有一定的抗血管形成的能力，Thalidomide、 IM862、Suramin已经开始了Ⅱ、Ⅲ期临床工作。
苏拉明（suramin）是一种临床上用于治疗锥虫病和丝虫病的药物，由于对肾皮质有选择毒性，最近被试用于治疗转移性肾皮质癌，表现出一定的抗癌活性。最近几年来发现苏拉明对多种常规化疗无效的恶性肿瘤如前列腺癌和淋巴瘤都有一定的治疗效果。这一化合物腹腔注射还能抑制人骨肉瘤在裸鼠上的生长。另外，在小鼠接种肿瘤前的1～2天，静脉注射一次苏拉明就能显著抑制B16－F10黑色素瘤和M5076网状肉瘤的肺克隆形成，最低有效剂量仅为10mg/kg体重。苏拉明体外抑制多种生长因子（包括PDGF、EGF、TGFβ、IGF－1）刺激的肿瘤细胞的生长和大多数内皮细胞生长因子（包括FGFs、VEGF）刺激的血管内皮细胞的生长。这一作用与苏拉明的分子结构密切相关。苏拉明是一种多磺酰萘酰尿素化合物，在生理条件下分子中多个磺酸基解离使分子具有较多的阴离子，这种负电性质的分子能聚集在aFGF、bFGF或PDGF分子上与之形成多聚体，从而阻止这些生长因子的活性，阻止肿瘤的新血管生成并抑制肿瘤的增殖。另外，苏拉明还可能抑制肝素酶，抑制肿瘤的侵袭，抑制运动信号传导中的关键酶（如肌醇磷酸和二酯酰甘油激酶），抑制蛋白激酶C、DNA多聚酶、拓扑异构酶Ⅱ，也能破坏G蛋白与受体的偶联。苏拉明抗肿瘤增殖和抗转移作用的原因是多方面的。目前苏拉明应用还受到很大的限制，因为其用药的安全范围很窄。苏拉明的一些衍生物，如把桥连苏拉明两末端萘环的四个芳香基团减少为两个，得到的几个化合物在小鼠体内的毒性比苏拉明至少减少了5～10倍，而其体外抑制bFGF诱导的血管生成的能力并不比苏拉明差。因此，改造苏拉明的结构，降低其毒性，提高治疗指数，可以使其成为一种有效抗肿瘤增殖和转移药物。
反应停（酞咪哌啶酮，Thalidomide）1953年在西德首先合成，1957年在西德、1958年在英国被作为一个非巴比妥类催眠药被推广应用，1961年因其致畸作用而被禁用。近年来由于动物及体外和体内实验发现其具有抑制血管生成等作用而具有抗肿瘤的潜能，因此逐渐受到人们的重视。反应停抗肿瘤的作用机制目前还不是很清楚，但相关实验提示可能跟以下机制有关：
1、抗肿瘤血管的生成（Antiangiogenesis）
这是目前普遍为人们所公认的，也是最令人欣喜的发现，尽管其作用机制并不很清楚，但已经有部分实验得出了肯定的结果。D. Amato等人于1991年发现口服反应停能够抑制兔角膜中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的表达，进而减少兔角膜血管的生成；同时反应停类似物的实验证明血管生成抑制作用与其致畸作用有关，而非镇静和免疫抑制作用。1999年D' Amato等人又报道他们新的研究成果：反应停与舒林酸（Sulindac）合用对bFGF和VEGF（血管内皮生长因子）诱导兔角膜血管生成的抑制作用（65%和74%），均比单独使用两种药物有增强。Babark等人的实验发现血管内皮能分泌caveolin—1，它在体内能反向调节VEGF—R的信号传导作用，从而发挥抑制VEGF的促血管生成作用，而VEGF、bFGF、肝细胞生长因子等的高浓度能抑制caveolin—1的表达，这可能是内皮细胞增殖的一个重要途径。他们以人类脐带内皮细胞ECV304为实验对象，用高浓度的上述因子作用，发现caveolin—1水平降低，而无论加入反应停，还是反应停与促细胞分裂蛋白激酶（mitogen-activited protein kinase）联合（尤其是后者）都能阻止这一VEGF诱导的下调（down-regulation）作用，可能起到抑制内皮增殖的作用。
2、抑制整联蛋白的表达。
整联蛋白（integrin）是由白细胞合成分泌的跨膜蛋白，包括α链（120-180KD）和β链（90-110KD）组成，能调节细胞与细胞外基质的相互作用：1、能与整联蛋白结合的序列是Arg-Gly-Asp（RGD），这一序列广泛存在于细胞外基质各成分中。整联蛋白的配体包括纤连蛋白，胶原，细胞粘附分子（ICAM-1），血管细胞粘附分子（VCAM-1）等。同时其胞内部分通过一系列连接蛋白（vinculin）与细胞结构蛋白肌动蛋白相作用。因此其参与了细胞间的粘附作用，把细胞外基质与细胞骨架连接起来；2、整联蛋白还是一种跨膜信号传递分子，通过调节蛋白酪氨酸激酶和磷酸激酶（如FAK、Src），对细胞信号传导，进而对细胞的增殖、凋亡、分化、运动均产生影响。研究发现细胞的恶变以及肿瘤细胞的转移与以上细胞行为的异常和肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘连相关。而实验研究还证明这种异常与整联蛋白的作用和表达的异常密切相关。提示可以通过抑制整联蛋白的合成分泌起到抗肿瘤的作用。对狨和人体的实验研究发现反应停能显著减少白细胞对整联蛋白亚基，尤其是β2、3的合成。这也许也是其抗肿瘤的作用机理之一。
3、抑制TNF—α的合成。
骨髓瘤细胞依赖IL—6的自分泌而生长（多种肿瘤细胞及细胞系如A549肺癌细胞、724膀胱癌细胞、子宫颈癌细胞均能表达IL—6mRNA并分泌IL—6），高TNF—α可刺激巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和血管内皮细胞分泌IL—1,6,8。相关研究还发现，在消化道肿瘤患者的腹水和血清中能查到IL—6和TNF—α活性明显增高。反应停能降解TNF—αmRNA从而抑制TNF—α的合成进而减少IL—6的产生，可以起到抑制这些肿瘤生长的作用。另外，TNF—α的高表达与肿瘤或AIDS引起病人的恶液质有关。提示可以利用其抗TNF—α作用来治疗恶液质，提高病人的生活质量。
在临床上对多发性骨髓瘤、前列腺癌、Kaposi肉瘤、乳腺癌及结肠癌等都有一定的疗效，作为与化疗结合的一个新方法，值得进一步研究。
以阻断肿瘤的血管生成为策略，研制开发的血管生成抑制剂将不同于传统的化疗药物，为抗肿瘤细胞的生长与转移提供了一条新途径.靶向血管治疗肿瘤是可行的，其优点是：①血 管内皮细胞基因稳定，无变异，故不易产生耐药性，肿瘤复发时给药仍有效.化疗药物的一 个主要问题是耐药性的产生，多数肿瘤细胞具有遗传不稳定性，易于发生突变而耐药.故血 管生成抑制剂的应用，将成为解决肿瘤耐药的一个新策略。②毒副作用少， 可长期用药.血管生成抑制剂作用于异常增殖的肿瘤新生血管内皮细胞，而对正常组织的影响轻微.故血管生成抑制剂不太可能造成胃肠道反应、骨髓抑制及其他内脏损害等传统的化疗药物造成的毒副反应。 ③一种药物可用于多种肿瘤，甚至非实体瘤（如白血病）。④一种药物可与多 种传统化疗药物共用，也可与其他抗血管生成药物共用。血管生成抑制剂疗 效的好坏决定于选择合理的治疗时机和治疗方案.与传统化疗、放疗的联合使用，将是血管 生成抑制剂的发展方向。一方面，血管生成抑制剂有可能提高传统化疗 、放疗的疗效；另一方面，手术治疗后处于肿瘤消退期的患者，应用血管生成抑制剂有可能使微小转移灶处于休眠状态，从而控制肿瘤的转移和复发。目前，血管生成抑制剂的临床应用主要存在两个问题：① 对自发性人类肿瘤的疗效是否与对实验性动物肿瘤的疗效相似；② 长期应用对人类会否产生毒副 作用.但随着对肿瘤转移分子机制的逐步深入了解，可供选择的作用位点已越来越多，为研 制更有效的血管生成抑制剂开辟了广阔的前景.尽管血管生成抑制剂在肿瘤治疗中的临床应 用价值仍有待于进一步验证，但其在肿瘤的长期休眠和抗转移治疗中，已初步显示出了良好的应用前景.
祖国医学中亦有许多值得开发的宝藏，如何开发中医药是值得进一步探讨的。近几年来，国内学者以抗肿瘤转移作为主要的研究方向，开展了一定的工作。新近研究中药雷公藤活性成份红素对血管内皮细胞抑制作用取得了一定的效果。以人脐静脉内皮细胞在体外的增殖、移动及小管形成能力为观察指标，发现红素在极低浓度下，在不杀死内皮细胞前提下，可以明显地抑制内皮细胞增殖、移动及小管形成，提示红素是值得进一步研究的中药成份。又如，另一项研究证明人参皂甙RG3在体外可以抑制血管内皮细胞的增殖，抑制小管形成，并抑制鸡胚CAM的血管形成，在体内研究证明对肿瘤生长有明显的抑制作用，组织学研究证明用药后肿瘤组织中血管密度明显降低，并见到组织中bFGF、MMP表达减少，提示人参皂甙RG3可能是一个值得进行进一步深入，有潜力的血管形成抑制剂。
总之，抗血管形成治疗是肿瘤治疗中的一个新的、安全有效的靶点值得进行进一步的深入研究的，正如诺贝尔奖获得者，加州大学分子生物学家米契尔·
